1941年，南京特别市立第一职业中学创办，设有会计、打字、缝纫专业。1945年，更名为南京市立第一职业学校。1950年，更名为南京市立财经学校。1953年，私立常州城北商业学校中技班和上海轻工业学校会计科并入，更名为南京工业会计统计学校，隶属轻工业部。1955年，学校划归铁道部管理，更名为南京铁路运输学校。
1958年，在全国大办高校的热潮中，南京铁路运输学校升格为南京铁道学院。然而，由于当时各地高校盲目扩张，超出了经济、产业和社会的实际发展水平，1959年，江苏开始大刀阔斧地合并、撤销高校，南京铁道学院在这轮调整中首当其冲，又复名为南京铁路运输学校，从本科跌落回中专，错过了成为知名高校的机会。1978年后，学校加强专业建设，开设中国首个铁道光纤通信专业。1999年，当选全国中专艺术教育研究协作组组长单位。
2002年，学校升格为高等职业技术学院，更名为南京铁道职业技术学院。2004年，由铁道部划转江苏省地方管理。2005年，江苏省教育厅与上海铁路局签订共建学院协议。学校的专业设置让机车专业的学生有机会开火车，城轨专业的学生能进地铁工作，供电专业的学生则可能与电线杆“打交道”。2006年，江苏省教育厅、上海铁路局和南京市浦口区人民政府签订三方共建学院协议。2007年，原苏州机电高等职业技术学校并入学院。2012年，南铁院苏州校区划入苏州大学。2012至2018年，学校先后与多所高校开展铁路应用型本科人才培养合作。学校的铁道类、城轨类专业是王牌专业，很多学生冲着进上海路局等单位而来。一个专业200多人可能只有两个女同学，有班级40人左右全是男生。据说专业前60%左右的学生可以包分配，能在火车上从事维修、乘务员工作，甚至有可能成为火车司机。大三上学期，各路局、地铁等单位就会来学校招聘，不少学生通过在学校的努力学*，成功进入铁路系统，实现月入过万，福利待遇优厚。
2018年，被评为江苏省教育国际合作与交流先进学校、江苏省来华留学生教育先进集体。2023年，牵头成立全国智能轨道交通自动化行业产教融合共同体。
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